Technologie: Online-Durchflusszytometrie
Vor Ort-Bestimmung von Bakterien und Partikel in industriellen Prozessen
Die noch relativ neue Online-Durchflusszytometrie ermöglicht eine nahezu Echtzeit-Überwachung von Bakterien und Partikel direkt in Produktions- oder Bioprozessen.
Um diese in Laboren etablierte Messtechnik auch in industriellen Umgebungen zuverlässig einsetzen zu können, war die Entwicklung einer robusten, störunempfindlichen Detektionseinheit erforderlich.
Diese muss gegenüber typischen Prozessbedingungen wie Staub, Vibrationen, Luftfeuchtigkeit, Temperaturschwankungen sowie Luftblasen in der Probe unempfindlich sein.
Eine zentrale Herausforderung lag in der stabilen, hydrodynamischen Fokussierung von Partikeln und Bakterien in der Messzelle, die einen kontinuierlichen, vollautomatisierten 24/7-Betrieb unter industriellen Randbedingungen ermöglicht.
Wird auf eine Fokussierung in der Messzelle verzichtet, handelt es sich nicht mehr um klassische, durchflusszytometrische Detektion, sondern um eine rein optische, streulichtbasierte Partikeldetektion. Werden die Zellen zusätzlich angefärbt, ist es mit gewissen Einschränkungen auch möglich, sie über Fluoreszenzmesskanäle zu erfassen.
Der Verzicht auf die Fokussierung reduziert den technischen Aufwand erheblich und kann dadurch zu deutlich geringeren Systemkosten führen.
Ohne echte Durchflusszytometrie (d. h. ohne saubere Einzelzellfokussierung) können typischerweise folgende Effekte auftreten:
Hydrodynamische Fokussierung
Bei der hydrodynamischen Fokussierung wird die Mantelströmung (Hüllstrom) genutzt, um den Probenstrom in der Messzelle zu einem schmalen, zentralen Flüssigkeitsfaden zu verengen, sodass die Zellen einzeln und hintereinander den Laserstrahl passieren.
Aufgabe der hydrodynamischen Fokussierung:
So befinden sich die Zellen präzise im Fokus des Lasers
Messzelle mit hydrodynamischer Fokussierung
Legende
Ausgang: Gemisch von Probe und Hüllstromflüssigkeit
Strömungsprofil in der Messzelle 
Messfenster (Interrogationszone)
Zellen und Partikel geordnet, umgeben vom Hüllstrom (Sheath Fluid)
Region der hydrodynamischen Fokussierung
Messzelle
Hüllstromflüssigkeit (Sheath Fluid)
Probenzufuhr, KapillareVorteile
Präzise Abbildung von Zellen und Partikeln Sehr hohe Reproduzierbarkeit der jeweiligen Messungen Hohe Präzision durch stabile, laminare Strömung in der Messzelle Verhindert Überlagerungen (Doubletten) von mehreren Zellen oder Partikeln Sehr verbreitete und etablierte Technologie in Labors Kompatibel mit klassischen Labor-Durchflusszytometern (Validierung)Nachteile
Industrielle, echte Durchflusszytometrie ist technisch anspruchsvoll und aufwändig Die Komplexität kann sich in den Kosten niederschlagen Die Hüllstromflüssigkeit muss, abhängig vom Messintervall, alle 4…6 Wochen ergänzt werden DFZ setzt präzise, volumetrische Fluidik vorausMesszelle ohne hydrodynamische Fokussierung
Legende
Ausgang der Probe Strömungsprofil in der Messzelle Messfenster (Interrogationszone) Zellen und Partikel ungeordnet Messzelle ProbenzufuhrVorteile
Gut geeignet für die optische Partikelmessung im Streulicht- und Vorwärtsstreulichtkanal Kostengünstige, optische Anordnung möglich Geeignet zur Messung von Partikeln > 1–2 µmNachteile
Verfügt über keine Fluoreszenzmesskanäle zur Detektion markierter Zellen Geringere Genauigkeit, da sich mehrere Partikel gleichzeitig im optischen Messbereich befinden können Partikel < 1 µm können nicht zuverlässig und prozesssicher erfasst werdenMesszelle ohne hydrodynamischer Fokussierung mit reduziertem Messfenster
Legende
Ausgang der Probe Strömungsprofil in der Messzelle verkleinertes, modifiziertes Messfensters (Interrogationszone) Zellen und Partikel ungeordnet Messzelle ProbenzufuhrVorteile
Ein solcher Messaufbau lässt sich kostengünstiger realisieren, da weniger Komponenten benötigt werden. Es wird kein Hüllstromfluid benötigt Die Anforderung an die Fluidik ist deutlich geringer und kann mit einer einzigen Pumpe erfüllt werden.Nachteile
Trotz der Reduzierung des Messfensters (Interrogationszone) können sich weiterhin mehrere Zellen und Partikel gleichzeitig im Messbereich befinden. Eine direkte Vergleichbarkeit mit klassischen Labor-Durchflusszytometern ist nicht gegeben, da es sich nicht um eine standardisierte Messmethode handelt. Da weniger als 50 % der fluoreszenzmarkierten Probe erfasst werden, ist die Repräsentanz der Messung eingeschränkt und muss mathematisch korrigiert werden. Es kann nicht gewährleistet werden, dass die Zellen das Messfenster einzeln und nacheinander passieren.Fazit
Eine durchflusszytometrische Detektion beruht in der Regel auf der hydrodynamischen oder akustischen Fokussierung des Probenstroms in der Messzelle, sodass Zellen vereinzelt und im Zentrum den Laserstrahl passieren und optisch analysiert werden können. Dadurch wird eine Einzelzell-Analyse in einem definierten, kontinuierlichen Fluss gewährleistet.
Erfolgt keine Fokussierung der Zellen und Partikel im optischen Messbereich der Durchflusszelle, passieren diese nicht sequenziell und einzeln den Laserstrahl, entspricht das System nicht der klassischen Durchflusszytometrie.
Eine Durchflusszytometrie ohne Fokussierung ist prinzipiell möglich, führt jedoch zu ungenauen, nicht reproduzierbaren Ergebnissen, da keine Einzelzellmessung gewährleistet ist. Daher sind Fokussiermethoden essenzieller Bestandteil der klassischen Durchflusszytometrie.
Der ONTRONIX Online Bacteria Analyzer (OBA) basiert ausschliesslich auf Durchflusszytometrie mit hydrodynamischer Fokussierung. Dadurch wird ein kontinuierlicher Probenstrom erzeugt, in dem Zellen vereinzelt den Messpunkt passieren und optisch individuell detektiert werden können.
